簡述PCR技術操作步驟
原理:
DNA聚合酶鏈式反應技術簡稱PCR技術,是一種以模板DNA為基礎,在引物和4種脱氧核糖核苷酸存在的條件下,利用DNA聚合酶的酶促反應,完成對模板的目的片段的快速擴增的過程。
步驟為:
(1)變性:雙鏈DNA在94℃條件下,通過熱變性使模板的雙鏈DNA氫鍵斷裂變成單鏈。
(2)復性:當變性温度突然降至引物Tm值(通常為35~65℃)以下時,會使引物與模板DNA互補序列雜交。由於引物一般由10~25個鹼基序列,模板DNA結構遠比引物分子複雜,且反應體系中引物分子的濃度又遠大於模板DNA,故在退火温度時,引物與模板DNA容易結合形成互補鏈。
(3)延伸:在DNA聚合酶的作用下,以DNA為模板和以4種脱氧核糖核苷酸為原料,在Mg2+存在的條件下。DNA聚合酶依賴於其5'→3'的聚合酶活力,以引物結合於DNA模板鏈為起始點。使引物的序列得以延伸,合成模板DNA的互補鏈。
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